昌幸や徳川家康、上杉氏は豊臣政権に臣従。後北条氏は天正18年（1590年）からの征伐（小田原合戦）により滅ぼされ、家康は関東に移封された。慶長3年（1598年）、秀吉が死去し、豊臣政権では五大老筆頭の地位にあった家康の影響力が強まる。反徳川勢力は五奉行の石田三成を中心に結集し、慶長5年（1600年）6月、家康が会津の上杉征伐の兵を起こして大坂を離れると、三成は毛利輝元を総大将として西軍を組織し挙兵した（関ヶ原の戦い）。昌幸は東軍を率いる家康に従っていたが、慶長5年（1600年）7月下旬、下野で次男・幸村とともに離反して上田に帰還し西軍に与した。これに対し、長男の信幸は東軍に従った。通説では、西東軍どちらが勝利しても真田一族が残れるよう分かれたとされる。
徳川家康率いる東軍は、下野国小山において三成ら西軍の挙兵を知って、軍を西に返した。この時、家康の本隊や豊臣恩顧大名などの先発隊は東海道を進んだが、徳川秀忠率いる3万8000人の軍勢は中山道を進んで西に向かった。そしてその進路に、真田父子が立て篭もる上田城があった。
秀忠は昌幸の嫡男・信幸に命じて、まずは無難に昌幸に対して開城を求める。老練な昌幸はのらりくらりと返事を先延ばしにして、時間稼ぎに徹する。秀忠は数日を空しく費やした後で昌幸の真意を知り激怒、上田城攻略を決意したとされる。このとき本多正信や徳川四天王の一人・榊原康政などは寡兵の真田氏を侮ることはせず、上田城を黙殺して西軍との主戦場（関ヶ原）に急ぐべきだと進言するが、土井利勝を始めとする戦場に疎い将が多かったこともあり、秀忠の決断を覆すことは出来なかった。そして牧野康成率いる手勢が昌幸の挑発に乗ったのをきっかけに戦端が開かれると、昌幸はわずか3500の兵力で徳川軍をかき回して混乱に陥れた。
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兵力的に圧倒する徳川軍であったが、地形的に兵力の優勢を生かし切れず、逆に地形を完全に掌握している地元の真田軍に巧みに翻弄され、敗北を喫したのである。このときのことを『烈祖成蹟』は「我が軍大いに敗れ、死傷算なし」と記している。秀忠は上田城が予想外に頑強であることに驚き、上田城に押さえの兵を残して先を急ぐことにする。しかし、この上田での遅延だけでなく道中の悪天候も災いして、遂に9月15日の関ヶ原本戦に遅参するという大失態を犯してしまった。この失態に家康は激怒し、秀忠にしばらくは対面することすら許さなかったと言われている。また、結果的に大敗のきっかけを作った康成・忠成父子は部下を庇って出奔したため、一時謹慎となった。
この戦いで、美濃で行われた関ヶ原での決戦に秀忠軍を遅参させることに成功したが、肝心の関ヶ原では西軍の敗北に終わり、西軍に与した昌幸と信繁は戦後処理で死罪を命じられたが、信幸とその岳父である本多忠勝の助命嘆願などもあって、一命を助けられてはじめ高野山、のち幸村が妻を同行させることを願ったため九度山に流罪となった。